Soo saarista iyo qeexidda bayoolaji ee boqoshaada lohodka ee laccase NRC 620 iyo qiimeynta waxtarkeeda ku aaddan caddeynta casiirka tufaaxa.

Ka dib 25 maalmood oo ku-shubid joogto ah heerkul ah 28°C, laccase oo ka timid *Pleurotus ostreatus* NRC620 ayaa muujisay firfircoonida ugu sarreysa ee habka dhaqanka fangaska. Qiimaha pH-ga ugu wanaagsan iyo heerkulka ee ensaymkan waxay ahaayeen 3.0 iyo 70°C, siday u kala horreeyaan. Ka dib 2 saacadood oo ku-shubid ah heerkul ah 40°C iyo 50°C, firfircoonida ensaymku waxay haysay 68.33% iyo 59.61%, siday u kala horreeyaan. Ka dib 2 saacadood oo ku-shubid ah oo ku jira kaydka citrate-phosphate (pH 7.0), firfircoonida ensaymku waxay sii ahayd 100%. Ku darista 10 mM MgSO₄ iyo CuSO₄ waxay kordhisay firfircoonida ensaymka qiyaastii 21% iyo 35%, siday u kala horreeyaan, halka NaCl, MnCl₂, KCl, iyo CaCl₂ ay joojiyeen dhaqdhaqaaqa ensaymka. Iyada oo ABTS loo adeegsanayo substrate ahaan, xuduudaha kinetic-ga (Km iyo Vmax) ee *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lacase waxay ahaayeen 1.99 mM iyo 16,217 μmol min−1 L−1, siday u kala horreeyaan. Daaweynta enzymatic ee muunadaha casiirka tufaaxa ayaa si weyn hoos ugu dhigtay pH iyo viscosity labadaba, hoos u dhacanina wuxuu la xiriiray kororka waqtiga kaydinta. Daaweynta Laccase waxay keentay hoos u dhac yar oo ku yimid wadarta guud ee phenolic ee casiirka tufaaxa, laakiin ma jirin wax hoos u dhac ah oo ku yimid waxqabadka antioxidant-ka.
Sannadihii ugu dambeeyay, cilmi-baarayaashu waxay diiradda saareen adeegsiga bayoteknoolajiyadda cagaaran ee warshadaha cuntada. Laccase waa mid ka mid ah ensaymyada ugu waxtarka badan warshadaha cuntada, iyagoo ka helaya codsiyada meelaha sida farsamaynta casiirka, dubista, xasilinta khamriga, iyo hagaajinta tayada organoleptic ee alaabada cuntada.¹Dhir badan oo sare iyo nooleyaal yaryar ayaa soo daaya laccase,²iyo fangaska sida deuteromycetes, ascomycetes, iyo basidiomycetes ayaa sidoo kale soo saari kara lacase.³Laccase (EC 1.10.3.2) waa oksaydh buluug ah oo yareeya oksijiinta molecular-ka biyaha iyadoo la adeegsanayo nidaam ka kooban saddex atam oo naxaas ah oo kala duwan, taasoo oksaydheynaysa iskudhisyo phenolic ah oo kala duwan iyo amiino udgoon. Inta lagu jiro soo saarista casiirka miraha iyo khudaarta, browning-ka enzymatic-ka iyo kuwa aan enzymatic-ka ahayn waa arrimo muhiim ah.⁴Maadaama walxahani ay si xun u saameeyaan midabka, dhadhanka, iyo caraf udgoonka casiirka, waa in laga saaraa.⁵
Dhammaan miraha, tufaaxu waa kuwa ugu isticmaalka badan adduunka iyo Midowga Yurub. Sannadkii 2019, wax soo saarka tufaaxu wuxuu ka galay kaalinta saddexaad adduunka, isagoo dhaafay 87 milyan oo tan.⁶Tufaaxa waxaa ku jira iskudhisyo badan oo phenolic ah, oo ay ku jiraan flavonoids iyo asiidhyo phenolic ah sida caffeic acid iyo chlorogenic acid.⁷Maadaama casiirka tufaaxa caadi ahaan loo isticmaalo qaabkiisa cad, qiyaastii 50% ilaa 90% qaybaha phenolic-ga ayaa lumiya inta lagu jiro habka shaandhaynta.⁸Maanta, macaamiishu waxay u janjeeraan inay doortaan badeecooyin aan si fiican loo warshadayn, sida casiirka tufaaxa daruuraysan oo leh polyphenol sare. Si kastaba ha ahaatee, sababtoo ah maadada phenolic-ga oo sareysa, noocan casiirka tufaaxa ayaa si gaar ah ugu nugul midab-beddel iyo mugdi.⁹Tiknoolajiyada kala duwan, oo ay ku jiraan hababka daaweynta kulaylka sida pasteurization-ka heerkulka 60-90°C, ayaa loo isticmaalaa in lagu yareeyo ama looga hortago mugdiga casiirka tufaaxa.¹⁰Si kastaba ha ahaatee, sida laga soo xigtay cilmi-baarista Sauceda-Gálvez¹¹, habaynta kulaylka waxay burburin kartaa kiimikooyinka isbeddela waxayna saameyn kartaa tayada organoleptic ee casiirka tufaaxa. Beddelka hababka habaynta kulaylka waxaa ka mid ah kaarboon laba ogsaydh oo aad u muhiim ah, shucaaca ultraviolet, ultrasound, cadaadis sare oo hydrostatic ah, ama isku-darka cadaadiska sare.¹²Waxtarka tiknoolajiyadan iyo wax soo saarka casiirka miraha ee ku habboon waxay ku xiran yihiin xuduudaha la isticmaalo iyo astaamaha badeecada. Isticmaalkooda ballaaran waxaa xaddidaya kharashyada sare, saameynta xun ee tayada cuntooyinka qaarkood, ama joojinta ensaymka oo aan ku filnayn.^13,14
Laccase waxaa loo isticmaali karaa in lagu xasiliyo laguna caddeeyo casiirka miraha.¹⁵Gökmen iyo kuwa kale.¹⁶Ku talinaynaa in la isticmaalo laccase si loo caddeeyo casiirka miraha sababtoo ah si wax ku ool ah ayuu uga saaraa isku-dhafka phenolic isagoo u beddelaya polymers ama oligomers oo si fudud looga saari karo xuubka ultrafiltration kasta, taasoo u oggolaanaysa casiirka tufaaxa inuu ilaaliyo midabka iyo hufnaanta deggan ilaa lix toddobaad heerkul ah 50°C. Laccase *Trichoderma* oo la nadiifiyey ayaa lagu joojiyey kuul alumina waxaana loo isticmaalay in si xulasho ah looga saaro isku-dhafka dhadhanka aan lahayn ee ay sababaan wasakhaynta microbial ee casiirka tufaaxa.¹⁷
Qiyaastii 80-90% qaybaha isbeddelka leh ee casiirka tufaaxa waa esters iyo aldehydes, kuwaas oo siiya caraf gaar ah casiirka.¹⁸Laccase laga sameeyay *Trametes versicolor* ayaa lagu joojiyay taageero jaban oo laga sameeyay faybar dabiici ah oo laga sameeyay qolof qumbaha yar yar si loo caddeeyo casiirka tufaaxa.¹⁹Daraasado hore ayaa baaray xasilinta casiirka tufaaxa (midabka iyo wasakhda) iyadoo la adeegsanayo hababka aan ensaymka lahayn ama aan dhaqdhaqaaq lahayn, ama iyadoo lala kaashanayo ultrafiltration.^5,19Si kastaba ha ahaatee, saameynta lakasyada fangaska ay ku leeyihiin sifooyinka fiisikokemikaalka ee casiirka tufaaxa inta lagu jiro kaydinta weli ma cadda. Sidaa darteed, ujeeddada daraasaddan waxay ahayd in si tijaabo ah loo baaro isbeddellada ku yimaada sifooyinka fiisikokemikaalka, waxyaabaha ku jira isku-dhafka phenolic, iyo dhaqdhaqaaqa antioxidant-ka ee casiirka tufaaxa ka dib marka lagu daaweeyo lakasyada fangaska iyo kaydinta qaboojiyaha laba toddobaad ah. Lakasyadu waxay leeyihiin awood ay ku oksaydhiyaan isku-dhafka phenolic, taasoo ka dhigaysa kuwo rajo leh in loo isticmaalo hababka kala duwan ee warshadaha, oo ay ku jiraan caddeynta casiirka. Daraasaddani waxay baartay lakasyada laga soo qaatay *Pleurotus ostreatus* NRC 620, iyadoo diiradda saareysa xaaladaha ku habboon firfircoonidooda iyo waxtarkooda ku aaddan caddeynta casiirka. Iyadoo cilmi-baarista ku saabsan boqoshaada lohodka (P. ostreatus NRC 620) ay weli xaddidan tahay, daraasadihii hore waxay baarteen ensaymyada laga helay ilo kala duwan oo fangaska ah, sida Trametes versicolor iyo Ganoderma lucidum. Ujeeddada daraasaddan waxay ahayd in la qiimeeyo adeegsiga suurtagalka ah ee ensaymkan ee warshadaha cuntada oo la muujiyo sifooyinkiisa gaarka ah, gaar ahaan pH-ga ugu habboon iyo heerkulka.
2,2′-Azooxybis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) waxaa laga soo iibsaday Sigma-Aldrich (Kanada). Dhammaan walxaha kale ee firfircoon waxay ahaayeen kuwo leh heer falanqayn.
Xarunta Ururinta Dhaqanka Microbial ee Xarunta Cilmi-baarista Qaranka waxay heshay nooca boqoshaada lohodka ee la yaqaan NRC620. Ka dib markii la beero hoosaad, noocaan waxaa lagu kaydiyay meelaha u dhow baradhada dextrose agar heerkulkiisu yahay 4°C. Habka diyaarinta inoculum wuxuu ahaa sidan soo socota: mycelium-ka 10-maalmood jirka ah, oo si buuxda u koray ayaa lagu tallaalay saxannada baradhada dextrose agar waxaana lagu kululeeyay 28°C. 10 maalmood ka dib, saddex baloog oo mycelium ah oo dhexroorkoodu yahay 12-mm ayaa laga soo saaray warbaahinta agar iyadoo la isticmaalayo feer bir ah oo nadiif ah waxaana lagu dhejiyay dhalooyin Erlenmeyer ah oo 250-mL ah oo leh fiilo cudbi ah oo ay ku jiraan 50 mL oo ah dhexdhexaad dhaqan oo la nadiifiyey (pH 5.0, sida uu hore u sharraxay Othman et al.²⁰). Dhaqamada waxaa lagu kululeeyay heerkul ah 28°C muddo 18 maalmood ah. Dabadeed dhaqamada waxaa lagu sifeeyay warqadda shaandhada ee Whatman No. 1, ka dibna waxa ka soo baxay wuxuu u adeegay sidii isha ensaymka.
Waxqabadka Laccase waxaa lagu go'aamiyay iyadoo la adeegsanayo ABTS oo ah substrate. Isku darka falcelinta (2 mL) wuxuu ka koobnaa 500 μL oo ah 0.3 mM ABTS (oo lagu milmay 0.1 M sodium citrate buffer, pH 4.5) iyo qaddarka loo baahan yahay ee muunadda ensaymka oo lagu qasi jiray biyo la safeeyey.^21,22Iyadoo la tixgelinayo in laccase uu oksaydhin karo ABTS heerkulka qolka (28 °C ± 2), oksaydhka ABTS waxaa lagu go'aamiyay iyadoo la cabbirayo kororka nuugista 420 nm (ε).₄₂₀= 36,000 cm^-1 M ^-1) iyadoo la isticmaalayo qalabka cabbira sawirka UV ee Agilent Carry-100. Hal unug oo ka mid ah dhaqdhaqaaqa laccase ayaa loo baahnaa si loo oksaydhiyo 1 μmol ABTS daqiiqaddii. Fiirsashada borotiinka waxaa lagu go'aamiyay habka Bradford iyadoo la adeegsanayo albumin serum lo'da ah oo ah xakameyn gudaha ah.^23,24
Ka dib markii ensaym laga helay nooca boqoshaada lohodka NRC 620, waxqabadkeeda waxaa lagu cabiray waqtiyo beeris oo kala duwan muddo 25 maalmood ah iyadoo xaalado aan degganayn lagu jiro 28 °C.
Si loo barto saameynta heerkulka ee dhaqdhaqaaqa laccase, tijaabooyin ayaa lagu sameeyay heerkulka u dhexeeya 20 ilaa 90 °C. Kahor inta aan lagu darin ensaymka oo aan la bilaabin falcelinta, kaydka (0.1 M sodium citrate, pH 4.5) iyo substrate (ABTS) ayaa la isku daray oo la kululeeyay 5 daqiiqo heerkul kala duwan. Xasiloonida kulaylka ensaymka waxaa lagu qiimeeyay ku-shubid 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) 40, 50, 60, iyo 70 °C muddo 2 saacadood ah, siday u kala horreeyaan. Dhaqdhaqaaqa haray ayaa markaa lagu qiimeeyay iyadoo la isticmaalayo substrate ABTS.
Saamaynta pH-ga ee dhaqdhaqaaqa laccase-ka waxaa lagu qiimeeyay iyadoo la adeegsanayo ABTS oo ah substrate ku jira 0.1 M citrate-phosphate buffers oo leh pH kala duwan oo u dhexeeya 2.5 ilaa 7.0. Xalka ensaymka waxaa lagu kululeeyay 40°C muddo laba saacadood ah oo lagu daray 0.1 M citrate iyo Tris buffers (pH 3, 4, 6, iyo 7) si loo qiimeeyo xasilloonida pH. Hadhaaga firfircoonida ABTS oo ah substrate ayaa la xisaabiyay ka dib markii la kululeeyay.
Laccase-ka waxaa lagu kululeeyay muddo 10 daqiiqo ah oo ku jirta sodium phosphate buffer (0.05 M, pH 7.0) oo ka kooban ion bir ah oo kala duwan (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, iyo Mn2+) iyadoo lagu darayo 2.5 mM iyo 10 mM, siday u kala horreeyaan. Substrate-ka (ABTS) ayaa markaa lagu daray si loo bilaabo falcelinta, waxaana la qiimeeyay dhaqdhaqaaqa qaraabada ah.
Oxidation-ka ABTS ee laccase oo lagu sameeyay cufnaan kala duwan (0.025–3 mM) ayaa lagu cabiray pH 4.5 si loo go'aamiyo xuduudaha dhaqdhaqaaqa (Vmax iyo Km).^{joogto ah}ee isle'egta Michaelis-Menten waxaa lagu xisaabiyay iyadoo la adeegsanayo sawir Lineweaver-Burk ah, kaas oo sawiraya heerka falcelinta ee isku-dhafka substrate-ka. Joogteynta dhaqdhaqaaqa waxaa laga xisaabiyay sawirka Lineweaver-Burk iyadoo la adeegsanayo barnaamijka GraphPad Prism nooca 6.01.
Ka dib markii si fiican loogu dhaqay tufaaxa biyo tuubo ah, waxaa loo jaray laba qaybood waxaana lagu daray casiir tufaax Braun MP80 ah oo si buuxda otomaatig ah u shaqeeya (laga sameeyay Jarmalka). Casiirkii waxaa lagu sifeeyay afar lakab oo farmaajo ah. Lama darin ensaymyo kooxda xakamaynta, halka 2.0% laccase (tirada ugu waxtarka badan ee la tijaabiyay) lagu daray casiirka tufaaxa ee cusub ee la diyaariyey, kaas oo markaa lagu kaydiyay heerkul ah 4°C muddo laba toddobaad ah.
Aashitada la kala saari karo (TA) iyo pH waxaa lagu go'aamiyay habka Boulton et^al.27pH-ga muunad kasta waxaa lagu cabbiray mitirka pH-ga dijitaalka ah (JENWAY 3510 pH meter). Aashitada Titratable (TA) waxaa lagu xisaabiyay iyadoo lagu saleynayo aashitada malic iyadoo la adeegsanayo qaacidada soo socota.
Halka V iyo C ay yihiin mugga (mL) iyo xoogga (0.1 mol/L) ee xalka sodium hydroxide ee loo isticmaalo titration-ka, siday u kala horreeyaan. K waa isku-darka beddelka aashitada malic, oo la mid ah 0.067, W-na waa cufka (g) ee casiirka tufaaxa.
Wadarta adag ee milmi kara (^TDS) waxa ku jira dhammaan muunadaha casiirka waxaa lagu go'aamiyay iyadoo la isticmaalayo qalabka cabbira PAL-1 ee jeebka lagu cabbiro (ATAGO, Tokyo, Japan). Ka dib cabbir kasta, muraayadda indhaha waxaa lagu raaciyay biyo la miiray, muunad kasta oo casiirka tufaaxa ah waxaa la tijaabiyay saddex jeer. Qiimaha muunad kasta waxaa lagu xisaabiyay celcelis ahaan saddexda cabbir. Celceliska ± heerka leexashada muunad kasta oo casiirka tufaaxa ah ayaa sidoo kale lagu xisaabiyay celcelis ahaan natiijooyinkan.
Shayga la isku dhejiyay ee muunadaha casiirka tufaaxa waxaa lagu qiimeeyay iyadoo la adeegsanayo qalabka cabbira wareegga (RV, Rheotest 2, Jarmalka). Muunadda waxaa la geliyay gudaha dhululubada "S2" ee qalabka cabbira. Shayga la isku dhejiyay waxaa lagu matalay jiirada cadaadiska shayga iyo qalooca heerka shayga, kaas oo laga xisaabiyay cadaadiska shayga iyo qaloocyada u dhigma ee heerarka shayga kala duwan (laga bilaabo 1.00 ilaa 437.4 s⁻¹). Qaacidada lagu xisaabinayo shayga muuqda waa sidan soo socota:
Halka η uu yahay isku-dhafka muuqda (cP), τ waa cadaadiska jarista (dyn/cm²), γ waa heerka jarista (sec⁻¹), iyo (τ) waxaa lagu xisaabiyaa iyadoo la adeegsanayo qiimayaasha wareegga (α) iyo dhululubada (Z) iyadoo la adeegsanayo qaacidada soo socota: τ = Z. α.
Tusmada bunniga waxaa lagu go'aamiyay habka Meidav ​​​​et^al.29Muunad casiir ah oo 10-ml ah ayaa lagu dhex shubay 2750 xg muddo 10 daqiiqo ah. 5 ml oo casiir ah ayaa lagu qasay 5 ml oo ah 95% ethanol. Neefsashada isku darka waxaa lagu cabiray 420 nm iyadoo la isticmaalayo qalabka Shimadzu UV spectrophotometer (UV-1601 PC).
Wadarta guud ee phenolic-ka (TPC) waxaa lagu go'aamiyay midab ahaan iyadoo la adeegsanayo falgalka Folin-Ciocalteu sida uu ku sharaxay Boulton et al.^[27]]. Qalooc caadi ah oo ah gallic acid ayaa loo sameeyay si loo helo uruurinta 0 ilaa 500 mg/L (^r²= 0.997). Natiijooyinka waxaa lagu muujiyaa sida u dhiganta aashitada gallic (mg GAE/mL).
Ku dar 125 μL oo biyo la sifeeyay ah iyo 2850 μL oo ah xalka FRAP 25 μL oo casiir tufaax ah oo isku darka u daa mugdiga.³⁰Daqiiqo. Kadib cabbir nuugista 593 nm adoo isticmaalaya Shimadzu UV spectrophotometer (UV-1601 PC). Reagent-ka FRAP waxaa lagu diyaariyey isku darka 300 mM acetate buffer (pH 3.6), 20 mM iron (III) chloride, iyo 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)triazine (TPTZ) (oo lagu milmay 40 mM HCl) saamiga 10:1:1. Qalooc caadi ah ayaa la sameeyay iyadoo la isticmaalayo Trolox oo ah heerka caadiga ah (^R²= 0.999), natiijooyinkana waxaa lagu muujiyaa μM Trolox/mL.
Waxqabadka antioxidant-ka ee casiirka la daweeyay iyo kan aan la daweyn waxaa lagu go'aamiyay iyadoo la adeegsanayo habka DPPH si loo qiimeeyo awooddooda ay ku nadiifin karaan xagjirrada xorta ah ee DPPH.³¹Toban litir oo casiir ah ayaa lagu qasay 1 ml oo ah xalka DPPH (100 μM) oo ku jira methanol. Ka dib markii falgalku mugdiga ahaa muddo 30 daqiiqo ah, nuugista isku darka waxaa lagu cabiray 517 nm iyadoo la isticmaalayo qalabka Shimadzu UV spectrophotometer (UV-1601 PC). Natiijooyinka waxaa lagu muujiyay inay yihiin kuwo u dhigma trolox (μM trolox/ml) iyadoo lagu saleynayo qalooca cabbiraadda (_^R2= 0.990).
Xogta la helay waxay muujisay in wax soo saarka ugu badan ee laccase-ka lagu arkay boqoshaada lohodka NRC 620 dhammaadka maalinta 18-aad ee halsano, taasoo gaartay dhaqdhaqaaq dhan 1302 U/L. Tani waxay u adeegtay saldhig u ah go'aaminta waqtiga ugu habboon ee beerista laccase-ka (Jaantuska 1). In kasta oo wax soo saarka ensaymka uu kordhay iyadoo la kordhinayo waqtiga beerista, heerka kororka ma ahayn mid si toos ah ugu dhigma wakhtiga beerista; ka dib 21 maalmood, dhaqdhaqaaqa ensaymka wuxuu kordhay 90 U/L oo keliya (ilaa 1390 U/L). Sidaa darteed, 18 maalmood ayaa ugu dambeyntii loo doortay waqtiga beerista ugu habboon si loo dheellitiro wax soo saarka badeecada iyo faa'iidooyinka dhaqaale ee waqtiga beerista oo kordhay.
Saamaynta waqtiga beerista ee wax soo saarka laccase ee Pleurotus ostreatus NRC 620. Saddex baloog oo mycelial fungal ah (12 mm) ayaa lagu tallaalay 50 ml oo ah meel nadiif ah ka dibna lagu beeray 28 °C waqtiyo kala duwan.
Sida laga soo xigtay daraasado kale, natiijooyinkayagu waxay muujinayaan in muddada ugu habboon ee lagu gaaro dheecaanka ugu sarreeya ee fangaska ay u badan tahay inay u dhaxayso 7 iyo 36 maalmood.³²Sida laga soo xigtay Ezike et al.³³, *Trametes polyzona* WRF03 waxay soo saartay xaddiga ugu badan ee lacase dhammaadka maalinta sagaalaad ee halsano, iyadoo leh hawl gaar ah oo ah 1637 U/mg borotiin. Intaa waxaa dheer, Othman et al.³⁴waxay ogaadeen in *Trichoderma harzianum* S7113 ay soo saartay xaddi badan oo laccase ah maalintii shanaad ee dhaqanka. Heerka wax soo saarka laccase wuxuu gaaray heerkii ugu sarreeyay maalintii afar iyo tobnaad ka dibna si tartiib tartiib ah ayuu u yaraadaa.³⁴In kasta oo dheecaanka ensaymku uu sidoo kale dhici karo inta lagu jiro marxaladda ugu weyn ee koritaanka, haddana badanaa wuxuu ku fidaa marxaladda dhexe waxaana kiciya isticmaalka isha kaarboon ama nitrogen.^34,35
In kasta oo laccase-ka laga helay Pleurotus ostreatus NRC 620 uu muujiyay firfircooni sare oo heerkul ballaaran ah laga bilaabo 50°C ilaa 80°C, isagoo ku dhow dhaqdhaqaaqa ugu sarreeya (69-98%), haddana dhaqdhaqaaqiisa ugu badan waxaa lagu arkay 70°C (Jaantuska 2a). Marka laga reebo heerkulkan, dhaqdhaqaaqa ensaymku wuxuu hoos u dhacay qiyaastii 70°C. Natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in ensaymku uu firfircoon yahay heerkul sare, taasoo u badan tahay inay sabab u tahay heerkulka sare wuxuu kordhiyaa tamarta dhaqdhaqaaqa ee falcelinta.
Saamaynta heerkulka falcelinta (a) iyo pH (b) ee dhaqdhaqaaqa laccase ee *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Heerkulka u dhexeeya 20 ilaa 90 °C waxaa lagu gaaray iyadoo isku darka hore loogu shubay heerkul kala duwan muddo 5 daqiiqo ah ka hor inta aan lagu darin ensaymka oo la bilaabo falcelinta. Saamaynta pH ee dhaqdhaqaaqa laccase waxaa lagu qiimeeyay iyadoo la isticmaalayo ABTS oo ah substrate xalal ka kooban 0.1 M citrate-phosphate buffer oo ku jira heerka pH ee u dhexeeya 2.5 ilaa 7.0.
Sida laga soo xigtay Ezike et^al.33, heerkulka ugu habboon ee *Trametes polyzona* WRF03 laccase waa 55 °C, kaas oo la mid ah kan *Ganoderma lucidum*^laccase36oo la mid ah heerkulka ugu habboon (50 °C) ee *Trametes polyzona* KU-RNW02737^lakas . ^Baldrian38Waxay xustay in, sida nidaamyada kale ee ensaymka ee lignin-degrading, heerkulka ugu habboon ee laccase uu yahay inta u dhaxaysa 50 iyo 70 °C.
Natiijooyinka waxay muujiyeen in ensaymku uu muujiyay dhaqdhaqaaqa ugu sarreeya ee pH 3.0, isagoo gaaray 94% firfircooni pH 3.5. Si kastaba ha ahaatee, wuxuu ku sii jiray firfircooni baaxad leh oo pH ah laga bilaabo 2.5 ilaa 7.0 (Jaantuska 2b). Intaa waxaa dheer, wuxuu muujiyay firfircooni sare xaaladaha aashitada marka loo eego xaaladaha dhexdhexaadka ah ama alkaline. Hawlgalkiisu wuxuu ahaa ugu yaraan 77% inta u dhaxaysa pH laga bilaabo 2.5 ilaa 4.5, laakiin wuxuu gaaray qiyaastii 38% oo keliya pH 7.0. pH-ga ugu fiican ee laccase laga bilaabo *Trametes polyzona* WRF03 wuxuu ahaa 4.533, kaas oo la mid ah pH-ga laccase laga bilaabo *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, iyo *Trametes hirsuta* 41. Si kastaba ha ahaatee, sida laga soo xigtay daraasadda Chairin et al.⁴², pH-ga ugu fiican ee laccase laga bilaabo *Polymorpha f. sp.* WR710-1 waa 2.2, halka pH-ga ugu fiican ee laccase laga bilaabo *Polymorpha f. sp.* IBL-04 waa 5.043. Ku xidhnaanta anions-ka hydroxide (laccase inhibitor) atamka naxaasta ee laccase-ka T2/T3 ayaa laga yaabaa inay sabab u tahay hoos u dhaca dhaqdhaqaaqa laccase-ka marka la eego xaaladaha pH-ga dhexdhexaadka ah ama alkaline-ka ah. Tani waxay carqaladeyn kartaa wareejinta elektaroonigga gudaha ee xarunta T1 una gudubta xarunta T2/T3, sidaas darteed^xaddidaaddadhaqdhaqaaqa ensaymka 23,44
Markii ensaymka lagu kululeeyo heerkul kala duwan, waxaa la ogaaday in waqtiga ku-meel-gaadhka iyo heerkulkuba ay saameeyeen xasilloonida ensaymka. Si gaar ah, laccase-ka laga helay *Trametes polyzona* NRC 620 wuxuu muujiyay xasillooni sare oo ah 40℃ iyo 50℃, isagoo haysta 68.33% iyo 59.61% dhaqdhaqaaqiisii ​​​​hore, siday u kala horreeyaan, ka dib 120 daqiiqo (Jaantuska 3a). Taas bedelkeeda, xaaladaha isku midka ah (40℃ iyo 50℃, 120 daqiiqo), laccase-ka laga helay *Trametes polyzona* WRF03 wuxuu haystay 64.38% iyo 42.92% dhaqdhaqaaqiisa, siday u kala horreeyaan.³³Taas beddelkeeda, kordhinta waqtiga ku-meel-gaadhka iyo heerkulka ayaa yareeyay xasilloonida *Trametes polyzona* NRC 620 lacase; Ka dib ku-meel-gaadhka 60℃ iyo 70℃ muddo 60 daqiiqo ah, waxqabadkeedu wuxuu hoos ugu dhacay 39.24% iyo 1.72%, siday u kala horreeyaan (Jaantuska 3a). Iyadoo la raacayo natiijooyinka tijaabada, laccase-ka laga helay *Trametes polyzona* WRF03 wuxuu muujiyay xasillooni sare oo ah 40 iyo 50℃ inta lagu jiro habka daaweynta kulaylka.³³Sidoo kale, Lueangjaroenkit et^al.37iyo Guddoomiye et^al.42waxay soo sheegeen xasilloonida lacases-ka laga helo Trametes polyzona KURNW027 iyo Trametes polyzona WR710-1 heerkul ah 50 °C muddo 1 saac ah, siday u kala horreeyaan. Maadaama ay tahay biocatalyst waxtar leh oo lagu dabaqi karo qaybaha kala duwan ee bayotechnoolajiyadda, lacase waa inuu lahaadaa xasillooni iyo waxqabad wanaagsan oo heerkul ballaaran ah.
Xasiloonida Heerkulbeegga (a) iyo xasilloonida pH (b) ee laccase laga bilaabo *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Xasiloonida Heerkulbeegga waxaa lagu qiimeeyay iyadoo xalka ensaymka lagu shubayo 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) 40, 50, 60, iyo 70 °C muddo 2 saacadood ah, siday u kala horreeyaan. Xasiloonida pH waxaa lagu qiimeeyay iyadoo xalka ensaymka lagu shubayo 0.1 M citrate buffer iyo Tris buffer (pH 3, 4, 6, iyo 7) heerkul ah 40 °C muddo 2 saacadood ah. Hawsha harsan waxaa lagu xisaabiyay iyadoo la isticmaalayo ABTS oo ah substrate ka dib marka la shubo.
Si loo go'aamiyo xaaladaha ugu wanaagsan ee isticmaalka iyo kaydinta ensaymka, waxaan baarnay saameynta pH ee xasilloonida laccase. Soo-gaadhista qiimayaasha pH ee kala duwan waxay si weyn u saamaysay xasilloonida qaab-dhismeedka borotiinka, taasoo saameyn ku yeelatay xasilloonida iyo dhaqdhaqaaqa molecule-ka ensaymka. Natiijooyinka waxay muujiyeen in ensaymku uu ka xasilloonaa xaaladaha aashitada, halka uu muujiyay xasillooni ka wanaagsan qiimayaasha pH ee sare (gobollada dhexdhexaadka ah iyo kuwa alkaline). Qiimaha pH ee 7.0, 6.0, 4.0, iyo 3.0, heerarka haynta ensaymka ka dib 120 daqiiqo waxay ahaayeen qiyaastii 100%, 62.54%, 52.39%, iyo 11.14%, siday u kala horreeyaan (Jaantuska 3b). *Strombus multisus* Laccase WRF03 wuxuu muujiyay xasillooni sare qiimayaasha pH ee dhexdhexaadka ah (5.5-6.5) iyo xasillooni hoose qiimaha pH-ga aashitada ah (ka hooseeya 4.0). Ka dib 120 daqiiqo qiimaha pH ee 5.5, 6.0, iyo 6.5, heerarka haynta ensaymku waxay ahaayeen qiyaastii 82%, 100%, iyo 93%, siday u kala horreeyaan.³³Khairin iyo kuwa kale.⁴²Waxay xuseen in laccase-ka ka yimid Trametes polyzona WR710-1 uu ahaa mid deggan oo ku jira heerka pH ee u dhexeeya 6.0 ilaa 7.0, halka Sayed et al.⁴⁵waxay muujisay in laccase uu aad u xasilloonaa xaaladaha pH-ga ee dhexdhexaadka ah. Si kastaba ha ahaatee, laccase-ka Cerrena unicolor ayaa sidoo kale muujiyay xasillooni xaaladaha alkaline (pH 9.0)⁴⁶Lakasyada la bartay waxay muujiyeen xasillooni sare oo ka sarraysa heerka pH-ga ballaaran. Tani waxay noqon kartaa astaamo muhiim u ah codsiyada warshadaha.
Maadaama qaar ka mid ah aayoonnada birta ahi ay leeyihiin saameyn kicinta iyo xakamaynta labadaba oo ku saabsan dhaqdhaqaaqa ensaymka, saameyntooda dhaqdhaqaaqa ensaymka waa in lagu tixgeliyaa codsiyada warshadaha. Tani waa muhiim sababtoo ah aayoonnada birta ahi waa wasakho deegaan oo caadi ah oo saameyn kara xasilloonida iyo isku-darka ensaymada ka baxsan jirka.⁴⁷Si aan u baarno saameynta ay ion-yada birta badan ku leeyihiin laccase-ka laga helo *Pleurotus ostreatus* NRC 620, waxaan sameynay tijaabooyin u dhigma. Sida ku cad Jaantuska 4, iyadoo ku xiran nooca birta la isticmaalay, kordhinta fiirsashada ion-ka birta laga bilaabo 2.5 mM ilaa 10 mM waxay si xun u saameysay shaqada ensaymka. Tusaale ahaan,^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺, iyo^Cu²⁺waxay kicin kartaa oo dhaqaajin kartaa dhaqdhaqaaqa ensaymka, halka^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺, iyo^K⁺waxay joojin kartaa dhaqdhaqaaqa ensaymka. Marka la eego 10 mM, ion-yada Cu²⁺ iyo Mg²⁺ waxay ahaayeen firfircoonayaasha ugu awoodda badan ee dhaqdhaqaaqa laccase ee ka yimid *Pleurotus ostreatus* NRC 620, iyagoo bixinaya heer firfircooni ah oo qiyaastii ah 34% iyo 20%, siday u kala horreeyaan. Si kastaba ha ahaatee, marka la eego 10 mM, ion-yada Ca²⁺ waxay ahaayeen kuwa ugu awoodda badan ee joojiya laccase, taasoo yareysay dhaqdhaqaaqa ensaymka qiyaastii 60%.
Saamaynta ay aayadaha birta ahi ku leeyihiin dhaqdhaqaaqa Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase. Laccase-ka waxaa lagu kululeeyay 10 daqiiqo iyadoo lagu shubay sodium phosphate buffer (0.05 M, pH 7.0) oo ka kooban aayadaha birta kala duwan ee xoogga 2.5 mM iyo 10 mM. Falcelinta waxaa markaa lagu bilaabay ku darista substrate-ka (ABTS), ka dibna waxaa la cabbiray dhaqdhaqaaqa qaraabada ah.
Natiijooyinkayagu waxay la mid yihiin kuwa qorayaasha kale ee ogaaday in Mg²⁺ iyo Cu²⁺ ay kor u qaadaan dhaqdhaqaaqa *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ waxay ogaadeen in laccase-ka ka yimaada *Xylaria* sp. uu kiciyo ilaa xad iyadoo la adeegsanayo ions-ka naxaasta ah (Cu²⁺). Intaa waxaa dheer, Foroutanfar et al.⁴⁹ iyo Si et al.⁵⁰ waxay sameeyeen daraasado la mid ah oo ku saabsan laccase-ka ka yimaada *Paraconiothyrium variabile* iyo *Trametes pubescens*, siday u kala horreeyaan. Goobta isku xidhka naxaasta nooca II (T2) ee ensaymkan waxaa lagu buuxin karaa Cu²⁺ marka la helo fiiro gaar ah, taas oo sharxi karta kicinta dhaqdhaqaaqa laccase-ka ee fiiro sare leh Cu²⁺³⁹. Maadaama fangaska qudhunsan ee cad ay yihiin oksaydhyo ka kooban atomyo badan oo naxaas ah, saameynta ay aayada naxaasta ku leeyihiin dhaqdhaqaaqa laccase-ku waa kala duwan yihiin waxayna u dhexeeyaan kicinta iyo xakamaynta ilaa dhexdhexaad.⁵¹ Taas bedelkeeda, Zhou et al.^[52]ayaa sheegay in^Cu²⁺waxay joojisay dhaqdhaqaaqa laccase ee termite-ka dhulka hoostiisa mara ee Taiwan (Odontotermes formosanus). Si kastaba ha ahaatee, laccase-ka Cerena sp. HYB07^[53]iyo Clitocybe maxima^[54]ma aysan saameyn ku yeelan ayoonnada naxaasta.
Gaar ahaanshaha substrate-ka waxaa lagu matalay xuduudaheeda kinetic-ga (Km iyo Vmax); marka uu sii xoogeysto isku xidhka substrate-ka ee ensaymka, qiimaha Km-ga ayaa hoos u dhacaya, halka uu sii kordhayaa gaar ahaanshaha substrate-ka.^3,21,55Xuduudaha kinetic-ga (Km iyo Vmax) ee laccase laga soo bilaabo *Pleurotus ostreatus* NRC 620 waxaa lagu go'aamiyay iyadoo la adeegsanayo barnaamijka GraphPad Prism 6.0 iyadoo la sawirayo sawirka Lineweaver-Burk (Jaantuska 5). Markii ABTS loo isticmaalayay substrate ahaan, natiijooyinku waxay ahaayeen 1.99 mM iyo 16217 μmol.^{ugu yaraan⁻¹ L⁻¹,}siday u kala horreeyaan. Elsayed et al.²¹ayaa soo sheegay in qiimaha Km ee oksaydhka ABTS uu ahaa 0.1 mM iyo 0.064 mM, siday u kala horreeyaan, taasoo muujinaysa isku xirnaanta sare ee isoenzymes-ka Lac A iyo Lac B ee ABTS. Intaa waxaa dheer, qiimayaasha Vmax waxay ahaayeen 0.182 μmol^{ugu yaraan⁻¹}iyo 0.603 μmol^{ugu yaraan⁻¹}, siday u kala horreeyaan. Qiimaha Km ee la helay wuxuu ka hooseeyay kan Trametes polyzona WRF03 (8.66 mM); intaa waxaa dheer, qiimahooda Vmax (1429 mmol min⁻¹) sidoo kale wuxuu ahaa^hoosemarka ABTS loo isticmaalayo substrate ahaan.33 Sidoo kale, qiimaha Km ee Lentinus squarrosulus MR13 iyo Trametes sp. AH28-2 laccase waxay ahaayeen 0.0714 mM iyo 0.025 mM, siday u kala horreeyaan, qiimayaasha Vmax-na waxay ahaayeen 0.0091 mM min−1 iyo 0.67 mM min−1 mg−1 (marka loo eego ABTS)^{, siday u kala horreeyaan.56,57}
Saamaynta fiirsashada ABTS ee dhaqdhaqaaqa laccase ee ka imanaya *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ayaa la baaray, waxaana la sawiray sawir Lineweaver-Burk ah oo ah is-dhaafsiga xawaaraha falcelinta bilowga ah iyo fiirsashada ABTS. Falcelinta oksaydhka ee ABTS oo leh fiirsasho kala duwan (0.025–3.0 mM) ee laccase ayaa lagu cabiray pH 4.5 si loo go'aamiyo xuduudaha kinetic-ga (Vmax iyo Km). Joogteynta kinetic-ga ee Michaelis-Menten waxaa lagu xisaabiyay iyadoo la adeegsanayo sawirka Lineweaver-Burk ee is-dhaafsiga xawaaraha falcelinta iyo fiirsashada substrate-ka. Joogteynta kinetic-ga waxaa laga xisaabiyay sawirka Lineweaver-Burk iyadoo la adeegsanayo software-ka GraphPad Prism 6.01.
Ensaymyada cadaynta dhaqameed, sida pectinases, hydrolyze walxaha pectic, waxay yareeyaan daxalka iyo wasakhda. Waxay si wax ku ool ah u burburiyaan polysaccharides-ka qaab-dhismeedka waxaana badanaa loo isticmaalaa iyadoo lala kaashanayo ensaymyada kale, sida cellulases iyo hemicellulases, si loo hagaajiyo wax soo saarka iyo cadaynta. Si kastaba ha ahaatee, pectinases si gaar ah uma bartilmaameedsadaan isku-dhafka phenolic, kuwaas oo ah kuwa ugu muhiimsan ee ka qayb qaata wasakhda iyo bunniga oksaydhka, gaar ahaan casiirka sida casiirka tufaaxa iyo canabka.⁵⁸Taas bedelkeeda, laccos-ku waxay kiciyaan oksaydhka isku-dhafka phenolic, iyagoo u rogaya molecules waaweyn oo aan milmi karin oo laga saari karo sedimentation ama shaandheyn. Habkani ma aha oo kaliya inuu hagaajiyo caddeynta laakiin sidoo kale wuxuu kordhiyaa cimriga sharaabka isagoo yareynaya suurtagalnimada bunni oksaydh ah oo ay keento isku-dhafka phenolic. Intaa waxaa dheer, hababka caddeynta ku salaysan laccos-ka waxaa lagu samayn karaa xaalado fudud oo wax lagu farsameeyo (pH 3.5–5.5, heerkulka 25–40 °C), taasoo ka dhigaysa kuwo ku habboon casiirka jilicsan iyada oo aan wax u dhimayn sifooyinkooda nafaqada ama organoleptic.⁵⁹Daraasaduhu waxay muujiyeen in daawaynta pectinase ay caddeyn karto casiirka 1-2 saacadood gudahood, halka daawaynta laccase ay caadi ahaan u baahan tahay waqti falcelin oo dheer (3-6 saacadood) si loo yareeyo isku-dhafka phenolic. Si kastaba ha ahaatee, habkan waxaa lagu hagaajin karaa iyadoo la joojinayo enzyme-ka ama la isku darayo laccase iyo hababka caddeynta farsamada.⁶⁰Daraasaddan, qaabaynta ensaymka ee soosaarka cayriin ayaa muujisay waxqabadyo muhiim ah oo lacase iyo α-amylase ah, halka hawlaha pectinase iyo xylanase ay aad u hooseeyaan, dhaqdhaqaaqa cellulase-na aan la ogaan. Sidaa darteed, hoos u dhaca wasakhda iyo waxyaabaha ku jira phenolic waxay inta badan sabab u ahayd ficilka lacase, halka isbeddelka viscosity-ga uu qayb ahaan sabab u noqon karo ficilka amylase.
Shaxda 1aad waxay muujinaysaa xuduudaha fiisikokimikada ee casiirka tufaaxa cusub ee la tuujiyay iyo muunadaha lagu daweeyay laccase. Natiijooyinku waxay muujiyeen in wax soo saarka casiirka tufaaxa cusub ee la tuujiyay (71.59%) uu ka hooseeyay muunadaha lagu daweeyay laccase (87.34%). Natiijooyinkani waxay la jaan qaadayaan natiijooyinka Pilnik iyo Orange.⁶¹, kuwaas oo tilmaamay in isticmaalka enzymes-ka habaynta miraha ay kordhin karaan wax soo saarka casiirka, hagaajin karaan shaandhaynta, iyo heli karaan casiir tayo sare leh oo cad si loo helo feejignaan. Kordhinta wax soo saarka casiirku waxay inta badan sabab u tahay kororka ku jira sonkorta milmi karta ee casiirka. Inta lagu jiro hydrolysis-ka enzymatic ee miraha, mesoglea iyo pectin ee derbiyada unugyada ee badeecada ayaa burbura oo isu beddela walxo milmi kara sida sonkorta dhexdhexaadka ah iyo asiidhyada^62.Qiimaha pH ee casiirka tufaaxa ee lagu daweeyay ensaymku wuxuu si weyn uga hooseeyay kan kooxda xakamaynta (P < 0.05), qiimaha pH ee labada kooxoodna si weyn ayuu u kordhay intii lagu jiray kaydinta (Jadwalka 1). Natiijooyinkani waxay la jaan qaadayaan kuwa Mark et al.⁶³, kuwaas oo xusay in pH-ga casiirka miraha cashew uu hoos u dhacay ka dib kaydinta ka dib daawaynta kulaylka. Burburka pectin iyo sameynta aashitada galacturonic ka dib daaweynta ensaymka ayaa laga yaabaa inay mas'uul ka noqdaan kororka pH inta lagu jiro kaydinta. pH-ga muunadaha lagu daweeyay ensaymka waxay ku jireen inta u dhaxaysa 4.05 iyo 4.31 inta lagu jiro kaydinta, halka pH-ga casiirka tufaaxa aan la daweyn uu u dhexeeyay 4.12 iyo 4.33.
Aashitada guud (TA) ee muunadaha aan la daaweyn iyo kuwa lagu daweeyay laacase waxay muujisay isbeddel hoos u dhac ah iyadoo la kordhinayo waqtiga kaydinta (Jadwalka 1). Hoos u dhaca aashitada waxaa loo aaneeyay beddelka aashitada dabiiciga ah ee karbohaydraytyada ama falgallada ensaymikada, iyo sidoo kale oksaydheynta inta lagu jiro kaydinta casiirka.⁶⁴Aashitada guud ee casiirka tufaaxa ee la xakameeyey iyo muunadaha lagu daweeyay ensaymku waxay ka hoosaysay tan casiirrada kale (casiir strawberry ah 0.9%, casiirka plum 2.2%, casiirka kumquat ah 1.0%, casiirka abrikotka ah 2.4%, casiirka liinta ah 0.8%), laakiin waxay la mid tahay tan casiirrada kale (tusaale ahaan, casiirka isteroberi 0.3%).⁶²Kala duwanaanshahan ku jira casiirka tufaaxa ee la tuujiyay ee aan la daaweyn waxaa sababi kara arrimo kala duwan sida xaaladaha koritaanka, arrimaha hidde-sidaha, heerka bisaylka, iyo hababka wax lagu farsameeyo.⁶⁵Hoos u dhaca aashitada guud ee xakamaynta iyo casiirka tufaaxa ee lagu daweeyay laccase waxay la jaan qaadayaan natiijooyinka ay soo bandhigeen Singh et al.⁶⁶ku saabsan hoos u dhaca aashitada guud ee casiirka tufaaxa Jin Nuo ka dib 74 maalmood oo la keydiyay. Dhanka kale, Oshmiansky iyo Wojdylo⁶⁷ma helin wax isbeddel ah oo muhiim ah oo ku yimid aashitada casiirka tufaaxa markii la baranayay saameynta hababka cadaynta dhaqameed.
Natiijooyinka lagu soo bandhigay Shaxda 1aad waxay muujinayaan in wadarta guud ee adkaha milma (TSS) ee casiirka tufaaxa ee lagu daweeyay laccase uu ka sarreeyay kan muunadda aan la daaweyn. Natiijooyinkani waxay la jaan qaadayaan daraasadaha la daabacay.^{. 68}Intaa waxaa dheer, Shaxda 1 waxay muujinaysaa in qiimaha TSS ee kooxda casiirka tufaaxa ee la xakameeyey uu ahaa 9.58 xilligii ugu horreeyay oo uu gaaray 11.05 dhammaadka muddada kaydinta. Qiimahani way ka hooseeyaan qiimaha TSS ee casiirka tufaaxa cusub ee ay soo sheegeen Hamid et al.^{. 69}(11.2 iyo 11.80, siday u kala horreeyaan). Qiimaha TSS ee muunadaha casiirka tufaaxa ee lacase lagu daaweeyay ayaa si weyn u kordhay, laga bilaabo 11.23 wuxuuna gaaray 12.93 ka dib laba toddobaad oo lagu keydiyay heerkul ah 4°C (Jadwalka 1). Koror la mid ah TSS intii lagu jiray kaydinta ayaa sidoo kale lagu arkay miraha liinta, liinta, iyo liinta macaan. Kordhinta adkaha milma ee wadarta guud (TSS) inta lagu jiro kaydinta waxay sabab u noqon kartaa hydrolysis-ka polysaccharides (istaarijka) ilaa monosaccharides (sonkorta), kororka xoogga ka dhasha fuuq-baxa casiirka, iyo burburka pectin ee casiirka una gudbaya adkaha milma. Kordhinta adkaha milma ee wadarta guud (TSS) waxay u badan tahay inay sabab u tahay kororka sonkorta milma, taas oo laga yaabo inay samaysmaan beddelka pectin ama cellulose una beddelaya sonkorta milma ee pectin ama cellulose, siday u kala horreeyaan, ama hydrolysis-ka istaarijka una beddelaya sonkorta, sida ay soo sheegeen Hamed et al.^69.Saamaynta laccase ee sifooyinka casiirka tufaaxa waxaa lagu arki karaa muuqaal ahaan, maadaama casiirka tufaaxa ee laccase lagu daweeyay uu muujinayo socod wanaagsan iyo daxal hoose marka loo eego casiirka aan la daweyn. Aragtidan waxaa lagu duubay Shaxda 1; Daxalaysiga muunadda lagu daweeyay ensaymku waxay ahayd 1.87 cP, halka daxalaysiga muunadda xakamaynta ay ahayd 2.95 cP. Hoos u dhacan weyn ee daxalaysiga waxay u badan tahay inay sabab u tahay awoodda sare ee biyaha lagu hayo ee walxaha u eg pectin iyo sameynta qaab-dhismeed shabakad isku xiran.
Daraasaddan, saameynta laccase ee tusmada bunniga (BI) ee casiirka tufaaxa waxaa lagu baaray iyadoo lagu cabbirayo nuugista 420 nm iyadoo la adeegsanayo spectrophotometer. Natiijooyinka waxaa lagu muujiyay Shaxda 1. Inta lagu jiro kaydinta, BI ee muunadaha casiirka tufaaxa ee kooxaha la daaweeyay iyo kuwa aan la daaweyn waxay muujiyeen isbeddel tartiib tartiib ah oo sii kordhaya. BI waxay ka tarjumaysaa heerka bunniga waxayna u adeegi kartaa sidii^{muhiim ah}tilmaame falgallada bunniga ensaymatiga ah iyo kuwa aan ensaymatiga ahayn. Nuugista ayaa si weyn u korodhay intii lagu jiray kaydinta (P < 0.05). Dhammaadka kaydinta,_A420Qiimaha muunadaha casiirka tufaaxa ee kooxaha xakamaynta iyo kuwa lagu daweeyay ensaymku waxay kordheen qiyaastii 217% iyo 121%, siday u kala horreeyaan (Jadwalka 1). Natiijooyinka waxay muujinayaan in daaweynta ensaymku ay si wax ku ool ah u yareyn karto heerka bunni-baxa qiyaastii 56%. Natiijooyinka Bezerra et al.^[19]] waxay la jaan qaadayaan natiijooyinkeenna; Waxay isticmaaleen faybarka laccase-glutaraldehyde-qumbaha si ay u caddeeyaan casiirka tufaaxa, iyagoo hoos u dhigay midabkiisii ​​asalka ahaa 61%.
In kasta oo polyphenols-ka ku jira casiirka miraha ay leeyihiin saameyn nafaqo iyo daaweyn oo togan oo ku saabsan jirka aadanaha, haddana waxay sidoo kale la falgeli karaan borotiinno, taasoo keenta daruuro casiir ah, wasakh, ama wasakh, taasoo beddeleysa dhadhanka iyo caraf udgoonka badeecada oo yareyneysa cimrigeeda.⁷¹Ujeeddada daraasaddan waxay ahayd in si ammaan ah loo yareeyo maaddada isku-dhafka phenolic ee casiirka tufaaxa iyadoo la isticmaalayo laccase laga soo qaatay Pleurotus ostreatus NRC 620. Natiijooyinka lagu soo bandhigay Shaxda 1 waxay muujinayaan in wadarta guud ee isku-dhafka phenolic ee casiirka tufaaxa ee lagu daweeyay laccase ay si weyn hoos ugu dhacday ka hor kaydinta 4 °C. Intaa waxaa dheer, wadarta guud ee isku-dhafka phenolic ayaa sidoo kale hoos u dhacday intii lagu jiray kaydinta labada muunadood ee la bartay (Jadwalka 1). Cilmi-baaris ay sameeyeen Sandri et al.⁷²waxay muujiyeen in casiirka tufaaxa ee lagu daweeyay ensaymku uu hayn karo firfircoonidiisa antioxidant-ka iyo maadada isku-dhafka phenolic. Si kastaba ha ahaatee, natiijooyinka daraasad ay sameeyeen Lettera et al.⁷³waxay muujinayaan in daaweynta casiirka liinta ee laacase fungal ay yareyn karto waxyaabaha ku jira isku-dhafka phenolic ilaa 45%.
Isku-dhafka phenolic waxaa la muujiyay inay leeyihiin astaamo sida xoqidda xagjirka xorta ah, yaraynta oksijiinta iyo deminta oksijiinta hal-halka ah, wareejinta atomka haydarojiin, iyo deeq elektaroonik ah oo loogu deeqo xagjirka xorta ah, taasoo ka dhigaysa kuwo awood u leh antioxidant-ka.⁷⁴Sidaa darteed, daraasaddan, hababka ku salaysan DPPH iyo FRAP ayaa loo isticmaalay in lagu qiimeeyo saameynta laccase ay ku leedahay dhaqdhaqaaqa antioxidant-ka ee casiirka tufaaxa ee lagu kaydiyay qaboojiyaha muddo 14 maalmood ah (Jadwalka 2). Labada habba waxay muujiyeen koror ku yimid dhaqdhaqaaqa antioxidant-ka inta lagu jiro kaydinta, taasoo laga yaabo inay sabab u tahay kororka isku-dhafka phenolic-ka xorta ah ama sameynta alaabada falcelinta Maillard (MRPs), iyadoo alaabada falcelinta Maillard ay u badan tahay inay sabab u tahay kororka dhaqdhaqaaqa antioxidant-ka.⁷⁵Falgallada bunni-samaynta ee aan enzymatic ahayn (oo ay ku jiraan burburka ascorbic acid, falgallada Maillard, iyo burburka aashitada ee sonkorta) waxay soo saaraan midabyo bunni ah (melanoidins). Badeecadaha burburka ascorbic acid ee dhexdhexaadka ah iyo badeecooyinka burburka sonkorta (sida isku-dhafka carbonyl) waxay la falgeli karaan aashitada amino iyada oo loo marayo falgallada Maillard.⁷⁶In kasta oo si ballaaran loo darsay diyaarinta miraha iyo khudaarta inta lagu jiro kaydinta, haddana fahamkeenna ku saabsan falcelinnadan ayaa weli xaddidan.⁷⁷Marka la barbardhigo habka FRAP, casiirka tufaaxa ee lagu daweeyay laccase wuxuu muujiyay waxqabadka antioxidant-ka oo aad u hooseeya habka DPPH (Jadwalka 2), dhaqdhaqaaqa antioxidant-ka ee dhammaan muunadaha ayaa si weyn u kordhay iyadoo la kordhinayo waqtiga kaydinta. Laba hab oo kala duwan oo lagu go'aaminayo waxqabadka antioxidant-ka ayaa loo isticmaalay daraasaddan sababtoo ah mabaadi'doodu way kala duwan yihiin. Habka DPPH wuxuu cabbiraa awoodda lagu dhexdhexaadinayo xagjirrada xorta ah, halka habka FRAP uu cabbiro awoodda lagu dhimayo ion-yada birta. Sidaa darteed, waxaa lagu talinayaa in la isticmaalo habab badan oo lagu go'aaminayo waxqabadka antioxidant-ka si loo fahmo dhaqdhaqaaqa antioxidant-ka ee muunadaha la bartay.⁷⁸
Mid ka mid ah natiijooyinka ugu muhiimsan ee daraasaddan ayaa ah in *Pleurotus ostreatus* laccase NRC 620 ay muujiso firfircooni ugu wanaagsan 70°C iyo pH 3.0. Marka la barbardhigo laccase-yada kale ee fangaska ee badanaa loo isticmaalo caddeynta casiirka, sida *Trametes versicolor* iyo *Ganoderma lucidum* laccase-yada, *P. ostreatus* NRC 620 waxay muujisaa xasillooni kuleyl oo sareysa iyo pH aashito badan. Laccase-yada ka yimaada *Trametes versicolor* iyo *Ganoderma lucidum* waxay caadi ahaan muujiyaan firfircooni ugu wanaagsan inta u dhaxaysa 50-60°C iyo qiimaha pH inta u dhaxaysa 3.5 iyo 5.0. Farqigani wuxuu gacan ka geysan karaa hagaajinta hufnaanta caddeynta casiirka, gaar ahaan casiirka aashitada leh halkaasoo xasilloonida qiimaha pH ee hooseeya ay muhiim tahay. Astaamaha gaarka ah ee *P. Marka la barbardhigo laccase-yada kale ee fangaska la bartay, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 waxay muujisaa awoodda ay si wax ku ool ah ugu shaqeyn karto xaalado adag. Heerkulka firfircoonida ugu fiican ee sare wuxuu soo jeedinayaa faa'iidooyin suurtagal ah oo ku jira codsiyada warshadaha, sida heerarka falcelinta degdegga ah iyo hoos u dhaca wasakhowga microbial. pH-ga hooseeya, kaas oo si fiican ugu habboon dabeecadda aashitada ee casiir badan, ayaa laga yaabaa inuu waxtar u yeesho hababka caddeynta casiirka. Natiijooyinkani waxay caddaynayaan sahamin dheeraad ah oo loogu talagalay codsi ballaaran, taasoo ka dhigaysa *Pleurotus ostreatus* NRC 620 beddel macquul ah oo ku habboon ilaha laccase-ka ee fangaska dhaqameed. Marka la barbardhigo daraasadihii hore, waxaan ogaanay in heerkulka ugu fiican uu yahay 60°C pH-gana uu yahay 3.0. Ka dib falcelinta 60°C muddo 80 daqiiqo ah, laccase-ka *Ganoderma lucidum* ayaa la hayaa⁴⁶% waxqabadkeeda.79 Sida laga soo xigtay Kurniawati iyo Nicelle⁸⁰, Ensaymada *Ganoderma lucidum* waxay muujiyaan xasillooni heer sare ah ilaa dhexdhexaad ah 25°C iyo qiimaha pH oo u dhexeeya 5.0 ilaa 8.0, iyo xasilloonida pH 6.0 iyo heerkulku wuxuu u dhexeeyaa 10 ilaa 30°C. Daraasaddan, waxaan ku ogaanay in pH-ga ugu fiican iyo heerkulka firfircoonida ensaymada ee *Pleurotus ostreatus* ay ahaayeen 3.0 iyo 70°C, siday u kala horreeyaan. Ka dib markii la geliyay heerkul ah 40°C iyo 50°C muddo laba saacadood ah, ensaymku wuxuu hayay 68.33% iyo 59.61% dhaqdhaqaaqiisa, siday u kala horreeyaan. Intaa waxaa dheer, Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase wuxuu muujiyay firfircooni sare oo heerkul ballaaran ah oo u dhexeeya 50°C ilaa 80°C, isagoo ku dhawaad ​​​​gaaray firfircoonida ugu badan (69%–98%), iyadoo dhaqdhaqaaqa ugu badan lagu arkay 70°C.
Gunaanadkii, laccase boqoshaada lohodka NRC620, oo laga helay xaalado aan degganayn, waxay muujisay firfircooni iyo xasillooni wanaagsan oo ku baahsan heerarka pH iyo heerkulka, taasoo muujinaysa xasillooni ka sarraysa ilo kale oo ensaym ah. Ku darista 10 mM MgSO₄ iyo CuSO₄ waxay kordhisay dhaqdhaqaaqa ensaymka qiyaastii 21% iyo 35%, siday u kala horreeyaan. Markii loo farsameeyay casiirka tufaaxa, ensaymku wuxuu yareeyay pH iyo viscosity, halka maadada phenolic ay yar yar hoos u dhacday intii lagu jiray kaydinta.
Natiijooyinku waxay xaqiijinayaan awoodda lacase ee warshadaha cuntada, gaar ahaan marka la eego caddeynta cabitaanka. Iyadoo si gaar ah loo kala jebinayo isku-dhafka phenolic, laccose ma aha oo kaliya inuu yareeyo wasakhda oo uu hagaajiyo caddeynta laakiin sidoo kale wuxuu ilaaliyaa tayada casiirka miraha xaaladaha fudud ee hawlgalka. Si ka duwan wakiilada caddeynta dhaqameed sida gelatin, bentonite, iyo silica gel, laccose ma soo saarto qashin ama ma ka saarto caraf udgoon oo wanaagsan cabitaannada, taasoo ka dhigaysa ikhtiyaar deegaan ahaan u fiican oo waara. Intaa waxaa dheer, marka la barbar dhigo ensaymada kale iyo hababka shaandhaynta, laccose wuxuu bixiyaa xal bartilmaameedsan oo kharash-ool ah iyada oo aan wax u dhimayn tayada badeecada.
Kyomuhimbo, HD iyo Brink, HG. Istaraatiijiyadaha codsiyada iyo joojinta dhaqdhaqaaqa ee lakasyada ay ku jiraan naxaasta; dib u eegis. Heliyon 9, e13156 (2023).